『絶対に笑ってはいけないホテルマン24時』（ぜったいにわらってはいけないホテルマンにじゅうよじ）とは2009年12月31日18:30（午後6時30分）から2010年1月1日0:30（午前0時30分、JST）にかけて、日本テレビのバラエティー番組『ダウンタウンのガキの使いやあらへんで!!大晦日年越しSP』として放送された企画である。この番組の番宣CMにおいて、キング・クリムゾンの「Twenty First Century Schizoid Man」の曲が使用された。テレビ大分を除く日本テレビ系列28局同時ネット。テレビ大分のみ2010年2月7日0:50 - 3:59、2月8日1:20 - 4:11（いずれもJST）の前後編に分けて放送された。2010年の1月10日と1月17日のレギュラー放送では、未公開シーンが放送された。5人がホテルマンに扮装し、バスに乗り込むところから罰ゲームスタート。笑った時の罰は従来の全身黒タイツの男達（「ブラックタイツ軍団」と表記されていた）による黒い棒でケツバット。判定方法は、笑ってしまうと不正解のBGMが流れ、藤原寛が「○○ アウト!」（全員の場合は「全員 アウト!」）と放送され罰が執行される。アウトのテロップに関しては、今回からは大きめの赤で白の細い縁取りをした斜体文字（書体はダイナコムウェアの綜藝体）が用いられるようになった。このほか、『Po Channel（ポーチャンネル）』（ペイチャンネルのパロディ、ロケと同時進行でヘイポー（斉藤敏豪）を24時間小屋に閉じ込め、ビビり続ける様子をモニタリングする）、ジミー大西のVTR（電話でのクレーム対応、政治評論家として解説）が行われた。当初は野外でのネタも予定されていたが、ロケ当日の天候悪化により中止されている。平均視聴率は関東地区で第1部（18:30 - 21:00）が16.4％、第2部（21:00 - 24:30）が15.4％を記録し、2年連続の15％超えとなった。2010年1月にガキの使いの通常回で放送。なお放送日は関東地区および同時ネット地域のもの。

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